鳴胚成纖維細(xì)胞具有相對(duì)容易獲得、增殖能力強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)、良好的耐受性、性狀比較穩(wěn)定等特點(diǎn)，使得其被廣泛地應(yīng)用于分子和細(xì)胞生物學(xué)研究的許多方面。

一，材料

1.孵育10d雞胚2只。

2．培養(yǎng)用液含10％CS的MEM、O．25％胰酶、PBS、D—Hanks液、CS等。

3．器皿與儀器鑷子、眼科剪、各種吸管、培養(yǎng)瓶、顯微鏡、培養(yǎng)皿、三角燒瓶、離心管、不銹鋼網(wǎng)、細(xì)胞計(jì)數(shù)器等。

二、方法

1．取雞胚取10d雞胚于蛋架上，用75％乙醇消毒蛋殼，用剪刀和鑷子去除氣室部蛋殼，用無(wú)菌彎頭小鑷輕輕取出雞胚，并放人無(wú)菌平皿中。

2．組織處理用彎頭小鑷夾起腹部皮膚，剪開(kāi)腹腔和胸腔去除雞胚內(nèi)臟，留下的雞胚組織用Hanks液洗2次。然后將雞胚組織移人小三角燒瓶?jī)?nèi)，用剪刀反復(fù)剪成lmm3大小的組織塊，用Hanks液洗2次。

3．消化將洗液上清液吸棄，根據(jù)沉下雞胚組織塊的多少，加入10倍量的O．25％胰酶，置37℃水浴中消化30min，消化時(shí)每隔5min搖動(dòng)一次，使組織塊散開(kāi)，視其組織碎塊變的疏松，從水浴鍋中取出。用毛細(xì)管輕輕吸出消化液，用Hanks液洗3次，加10ml生長(zhǎng)液(不加血清)，用吸管反復(fù)吹打，使細(xì)胞分散，然后將分散好的細(xì)胞懸液通過(guò)不銹鋼網(wǎng)·補(bǔ)足10％CS或加10％FBS，制成細(xì)胞懸液。

4．細(xì)胞計(jì)數(shù)與分裝取上述獲得的單細(xì)胞懸液少量，進(jìn)行1：5稀釋后計(jì)數(shù)，然后調(diào)細(xì)胞濃度為O．5×106／ml，分裝于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。待細(xì)胞培養(yǎng)有一定經(jīng)驗(yàn)后，可省略細(xì)胞計(jì)數(shù)步驟，而憑經(jīng)驗(yàn)估計(jì)細(xì)胞濃度，如一只10日齡雞胚制成lOml細(xì)胞懸液時(shí)細(xì)胞數(shù)約為4×106／ml，也可視其懸液的透明度來(lái)估計(jì)。

三、結(jié)果觀察

    將上述培養(yǎng)物置37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每天對(duì)培養(yǎng)接種的細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)檢查，觀察的主要內(nèi)容有：細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、污染與否、pH等。如培養(yǎng)液為橘紅色，一般說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)良好。一般于24h后可見(jiàn)到許多細(xì)胞貼壁，由圓形懸浮狀態(tài)的細(xì)胞延展成短梭形。2～3d后長(zhǎng)成單層細(xì)胞，換維持液后即可用于實(shí)驗(yàn)，或經(jīng)傳代后再長(zhǎng)成單層細(xì)胞時(shí)使用。

四、注意事項(xiàng)

    消化時(shí)溫度不能高于37℃，消化時(shí)間不宜過(guò)強(qiáng)。如果胰酶消化過(guò)強(qiáng)，則細(xì)胞易被損傷不宜生存。