(一)形態(tài)學(xué)鑒定

1．光學(xué)顯微鏡檢查

(1)培養(yǎng)瓶(皿)或培養(yǎng)板直接置于倒置顯微鏡下觀察，上皮細(xì)胞呈多邊形，邊界清晰，大小規(guī)則，核呈圓形，核質(zhì)比例小，細(xì)胞間排列整齊，為單層培養(yǎng)物，無重疊生長，是正常上皮組織來源；成纖維細(xì)胞呈長梭形，核小而圓，細(xì)胞排列規(guī)則、整齊，為單層培養(yǎng)物，無重疊生長，是正常間質(zhì)組織來源。腫瘤組織來源的貼壁細(xì)胞，其單層培養(yǎng)物呈多層重疊生長。

(2)細(xì)胞染色檢查：將無菌小玻片(O．5cm×2cm)于細(xì)胞傳代接種前放人培養(yǎng)瓶皿內(nèi)，接種細(xì)胞懸液后培養(yǎng)，在玻片上制備培養(yǎng)的單層細(xì)胞，然后將載有細(xì)胞的玻片取出，用磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffeer saline，PBS)輕輕漂洗后，將玻片放在普通玻片上，空氣中自然干燥。經(jīng)PBS／甲醇(1：1)固定液同定15min，棄固定液，加吉姆薩(Giemsa)染色液染色10～15min，用清水漂洗干凈，置于空氣中干燥，用二甲苯透明，用光學(xué)樹脂膠片封片后觀察。上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的形態(tài)與直接鏡檢相同，細(xì)胞核染成紫紅或藍(lán)紫色，胞質(zhì)染成粉紅色。

2．電子顯微鏡觀察通常用透射電鏡檢查細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，加培養(yǎng)液懸浮消化的細(xì)胞，用1000r／min離心5min。收集離心管底部細(xì)胞，經(jīng)戊二醛固定，包埋，超薄切片；也可采用細(xì)胞原位包埋的方法，將細(xì)胞培養(yǎng)于電鏡用特殊膜上，進(jìn)行固定，包埋，該法不破壞細(xì)胞問排列關(guān)系。在電鏡下可見到上皮細(xì)胞的張力原纖維和橋粒等，腺細(xì)胞可見胞質(zhì)中的分泌顆粒，這對確定培養(yǎng)細(xì)胞系組織來源有重要意義。

(二)細(xì)胞核型分析

    細(xì)胞染色體核型分析能簡易、有效地確定細(xì)胞種來源和鑒定正常或惡性的性質(zhì)，以及檢查細(xì)胞有無交叉污染等。細(xì)胞染色體核型分析包括制備中期細(xì)胞分裂象樣本，將分散的單個染色體進(jìn)行計數(shù)和排列分組分析。

1．制備細(xì)胞分裂樣本取對數(shù)生長期的細(xì)胞懸液，加入1×1 0-5 mol／L秋水仙素(終濃度為1×10-7mol／L)到養(yǎng)液中，處理6h后，輕輕吸出培養(yǎng)液，加0．25％胰蛋白酶消化細(xì)胞或手振搖培養(yǎng)瓶使細(xì)胞脫落，收集中期分裂象細(xì)胞，37℃靜置20min后加入冰醋酸一甲醇(1：1)1ml，固定細(xì)胞1～20min，再次以1000r／min離心：10min，去上清液，加入新固定液，吹打混勻，第3次經(jīng)1000r／mln離心10min，收集分裂象細(xì)胞。

2．制備染色體玻片將沉集的細(xì)胞加入O．2ml醋酸甲醇分散細(xì)胞，取一滴細(xì)胞懸液加到冰冷的玻片上，同時用口吹散細(xì)胞液滴，使細(xì)胞均勻分散于玻片上。同時可多制備幾張染色體玻片，待干燥后染色、鏡檢。

3．染色體計數(shù)及核型分析取染色體玻片經(jīng)吉薩姆染色后鏡檢。在顯微鏡下可觀察到多個中期分裂象細(xì)胞染色體，計數(shù)50～100個細(xì)胞染色體數(shù)目，并計數(shù)出細(xì)胞染色體的分布，細(xì)胞群體中分布zui多的染色體數(shù)目是染色體數(shù)。人正常細(xì)胞有46條染色體，為23對二倍體。染色體分組排列，每組染色體無增加或減少，無異常染色體。小鼠染色體為40條，不僅數(shù)目與人染色體不同，而且以頂端著絲點(diǎn)為主。人的染色體則為中央著絲點(diǎn)，數(shù)目與著絲點(diǎn)位置可作為細(xì)胞系是人或鼠來源的依據(jù)。

(三)細(xì)胞DNA指紋技術(shù)檢測

    利用DNA指紋技術(shù)(DNA finger printing)檢測細(xì)胞基因多態(tài)性，對于判斷所建立的細(xì)胞系來源非常有用。細(xì)胞系的基因多態(tài)性應(yīng)與其來源的個體基因相似，所以應(yīng)保留原代組織或來源個體的血液作為對照樣品。

1．制備細(xì)胞DNA的雜交膜

(1)用胰蛋白酶消化培養(yǎng)細(xì)胞，將消化的細(xì)胞用．PBS洗2～3次，1000r／min離心5min，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞DNA，用紫外分光測DNA含量。DNA經(jīng)EcoRI酶切，37℃處理，并取少量樣品經(jīng)瓊脂糖電泳，應(yīng)看到有大于5kb的DNA條帶出現(xiàn)。

(2)將酶切處理的DNA加入6×上樣緩沖液混勻，上樣到分析膠上，同時應(yīng)有其他已知細(xì)胞系的酶切DNA為對照，以及與分子量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)志物一起電泳(3V／cm)，直到分子量際準(zhǔn)HindⅢ酶切*片段(23kb)已泳動出一定距離(電泳17～20h)，在紫外燈下照相記錄。

(3)分析膠變性后進(jìn)行Southern印跡雜交分析。將分析膠中的DNA電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，取出膜暴露于紫外線(302nm)下5min，然后放人干燥的雜交袋中保存，待雜交。

2．制備標(biāo)記M13噬菌體探針

(1)放射性同位素標(biāo)記M13：DNA取稀釋的M13噬菌體2μl與1μ1無菌蒸餾水混合于離心管中，放人沸水中2min，再放冰上5min，然后加11．4μl的緩沖液和0．5μl牛血清白蛋白，加入10μl a一[32P]一dGTP、2μl Klenow酶，混合管中的內(nèi)容物，短暫離心1次，放置溫室。

(2)純化M13 DNA探針：將放置的上述內(nèi)容物吸出，加到已平衡好的葡聚糖(sephadex)柱內(nèi)，上2×40μI過柱緩沖液，收集2次400μ1緩沖液的洗出液放人離心管內(nèi)，作為探針。將放有探針的離心管放入沸水中2min，移至冰上冷卻，待雜交用。

3．DNA雜交用標(biāo)記好的M13探針與細(xì)胞DNA進(jìn)行Southern印跡雜交分析。首先將轉(zhuǎn)移膜放入預(yù)熱的預(yù)雜交液袋中，置55℃振搖4h，然后移到預(yù)熱的雜交液袋中，于55℃，同時加入探針進(jìn)行雜交。次日將雜交后的轉(zhuǎn)移膜置洗液中室溫漂洗15min，共洗2次，再用預(yù)熱55％含有O．1％SDS的洗液沖洗，于55℃振搖15min。zui后用1×SSC液洗膜，置濾紙上自然晾干。用放射性檢測儀檢查膜上存在的放射性同位素，進(jìn)行放射自顯影，沖洗x線膠片。

    自顯影膠片上顯示細(xì)胞DNA的電泳帶型和組織來源細(xì)胞DNA對照的帶型等，這對于鑒定細(xì)胞種的來源和組織來源提供了非常有用的證據(jù)，因為每個細(xì)胞系(除與組織來源的細(xì)胞)有*的帶型。

(四)同工酶檢查

    不同種系的細(xì)胞和同一種系不同組織之間同1二酶的表達(dá)呈多形性，酶功能雖相同，但結(jié)構(gòu)各異，正常和腫瘤組織細(xì)胞之間的同工酶也不同，因此檢測同工酶對于鑒定細(xì)胞系很有價值，常用于檢測的同工酶有核苷酸磷酸酶(nucleoside phosphorylase)、葡萄糖6磷酸脫氫酶(glucose一6一phosphate dehydrogenase，G6PD)、蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase，MD)、乳酸脫氫酶(1actate dehydrogenase，LD)。

    同工酶的鑒定應(yīng)先收集細(xì)胞，分別提取標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞、對照細(xì)胞及檢測細(xì)胞的提取液，即*溶解上述細(xì)胞(細(xì)胞膜呈云霧狀)，離心取上清液。制備凝膠，上樣(細(xì)胞提取液)進(jìn)行電泳，可用瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠兩種方法電泳。取下凝膠，同酶試劑反應(yīng)，即針對不同酶加入相應(yīng)的底物顯色，進(jìn)行檢測。檢測細(xì)胞系的同工酶譜具有特異的帶型．與原取材組織相同，但與對照細(xì)胞、標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞比較，即可區(qū)分出人和鼠等種系的細(xì)胞來源。

(五)抗原標(biāo)記

    細(xì)胞表面抗原可作為鑒定細(xì)胞來源的重要標(biāo)志物，如上皮細(xì)胞表面特異性抗原可與正常上皮細(xì)胞熒光抗體結(jié)合，在熒光顯微鏡下可見細(xì)胞表面出現(xiàn)熒光，作為正常上皮細(xì)胞的標(biāo)志。也可用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme—linked immunosorhent assay，ELISA)檢測。

(六)細(xì)胞生長實驗

    正常細(xì)胞的生長與腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有明顯差別。正常細(xì)胞移植到裸鼠體內(nèi)無浸潤生長，不形成腫瘤；另外，在培養(yǎng)器皿中生長具有形成單層(具有接觸性抑制)、飽和密度及停泊依賴等特點(diǎn)。