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為您帶來ELISA實驗優(yōu)化做到這五點,下個大神就是您!
更新時間:2019-08-19   點擊次數(shù):1151次

為您帶來ELISA試劑盒實驗優(yōu)化做到這五點,下個大神就是您!

一、封閉液、洗滌液及保護液的優(yōu)化
    1.封閉液的優(yōu)化:采用文獻報道的方法進行封閉。其封閉液的組成為:10mM磷酸鹽緩沖液含1%的牛血清白蛋白(BSA)。
    2.洗滌液的配制:采用文獻報道的方法配制洗滌液。
    3.酶標板保護液的優(yōu)化:酶標板經(jīng)過封閉后在低溫下僅能存放2周左右,為了延長固相酶標板上抗原的穩(wěn)定性,我們增加了一步保護酶標板的程序。在10mM的磷酸鹽中加入適量的糖、無關(guān)蛋白質(zhì)、慶大霉素以及二價金屬離子,作為酶標板保護劑,在封閉完后加入保護液于4℃冰箱中孵育放置一個晚上,同時與未做保護的酶標板進行對照,然后將保護的及未保護的酶標板置于37烘箱中放置15天,考察保護液對酶標板的穩(wěn)定性的影響。

二、酶標抗體稀釋度的優(yōu)化
    抗原包被濃度為4ug/ml,將酶標抗體做系列稀釋:1:100,1:200;1:300;1:400;1:500;1:600;1:1000;經(jīng)孵育、洗滌后、顯色終止后,用自動酶標儀分析,選擇A值為1.5左右的酶標抗體稀釋度為zui適工作濃度。
 

三、底物液的優(yōu)化
    常用的作為酶聯(lián)免疫吸附試劑有OPD和TMB系統(tǒng),由于OPD有致癌的危險性以及用前需要溶解等諸多缺點,因此我們選用TMB作為底物系統(tǒng),采用文獻報道的方法:取適量的TMB溶解在DMSO中,然后加入適量的超純水,配制作為底物B液;溶解適量的過氧hua氫尿素于100mM磷酸-檸檬酸緩沖液中,配制作為底物A液,用前將底物A液及底物B液等體積混合。在文獻報道的基礎(chǔ)上,上海樊克適當調(diào)整了TMB的用量以及過氧hua氫尿素的用量,并加入了酶促進劑,與文獻報道的底物進行比較。實驗方案為:將活化的辣根過氧hua物酶分別作1:1000;1:10000;1:100000;1:200000;1:400000;1:800000等系列稀釋,比較兩種不同配方的底物的靈敏度。
 

四、抗原抗體反應(yīng)時間的優(yōu)化:
    抗原抗體反應(yīng)會隨著時間的增加,反應(yīng)量也增加,但達到一定的時間后,反應(yīng)即達到平衡,我們?nèi)》磻?yīng)10min,20min,30min,40min,50min,60min,70min,90min等8個點進行比較,以確定zuijia抗原抗體反應(yīng)時間。
 

五、底物作用時間的優(yōu)化
    在其它條件相同的情況下,我們?nèi)?min,10min,15min,20min,25min,30min,35min,40min,50min,60min,80min等11個時間點進行比較,確定zuijia的底物作用時間。
 

 

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